RESUME JURNAL
Transformasi Genetik Nicotiana benthamiana dengan
Gen CP untuk Mendapatkan Ketahanan Tanaman terhadap Peanut Stripe Virus
Nur YASIN
Jurusan Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian,
Universitas Lampung,Jl. Prof. Dr. Sumantri
Brojonegoro 1, Bandar Lampung 35145
Di
Indonesia, PStV (Peanut Stripe Virus) menjadi masalah dalam usaha
budidaya kacang tanah. Perkembangan teknologi DNA rekombinan telah memberikan
harapan dan ca-krawala baru dalam mengatasi penyakit yang disebabkan oleh virus
tanaman. Transfer gen pada tanaman telah dapat menghasilkan tanaman transgenik
yang mengandung gen asing yang berfungsi dan terintegrasi ke dalam genom
tanaman tersebut. Beberapa metode telah dikembangkan untuk membuat tanaman
transgenik. Salah satu metodenya adalah penggunaan Agrobacterium tumefaciens.
Karena kemampuannya untuk melakukan rekayasa sel tanaman secara genetik
melalui T-DNA maka setiap strain A. tumefaciens secara alami mampu melakukan
rekayasa genetika tanaman.
Gen coat protein (CP) kini telah
dapat dimanfaatkan dalam rekayasa genetika tanaman. Gen CP telah digunakan dalam
penelitian untuk mendapatkan tanaman kedelai transgenik yang tahan terhadap Soybean
dwarf virus (Tougou et al., 2007). Dalam penelitian ini digunakan 4 tipe
konstruksi gen CP yang ditransformasi ke tanaman model Nicotiana benthamiana
dengan bantuan A. tumefaciens AGL0. Inokulasi virus
untuk pengujian ketahanan tanaman transgenik model terhadap PStV (Peanut
Stripe Virus) menggunakan cara mekanik.
Penelitian ini bertujuan untuk
mengevaluasi (1) transformasi genetik (proses rekayasa genetika) tanaman dan
(2) ketahanan tanaman transgenik model (Nicotiana benthamiana) generasi
T0 yang membawa beberapa tipe gen CP (Tabel 1) dan gen GUS terhadap infeksi
PStV. Beberapa tanaman yang diuji adalah (a) tanaman transgenik yang membawa
tipe gen CP PStV sebagaimana yang dipunyai oleh cistron CP dari genom PStV (gen
CP-1), (b) tanaman transgenik dengan gen CP PStV yang telah mengalami mutasi
titik alias kehilangan DAG-box motif-nya (gen CP-2) , (c) tanaman
transgenik dengan gen CP PStV yang mengekspresikan mRNA dan mRNA-nya yang tidak
dapat ditranslasi menjadi protein (gen CP-3), dan (d) tanaman transgenik dengan
gen CP PStV yang mengekspresikanbagian tengah CP (gen CP-4).
Adapun bahan dan metode yang diperlukan sebagai
berikut:
Penyediaan
Kultur Agrobacterium
Untuk
menyegarkan stok Agrobacterium, bakteri, yang masing-masing
membawa gen marker atau salah satu dari tipe gen CP PStV, dari stok penyimpanan
dibiakkan di cawan petri yang mengandung media YEP, antibiotik rifampisin (20
mg/l), dan kanamisin (50 mg/l). Biakan ini diinkubasi selama dua hari pada
ruang inkubasi dengan temperatur 28oC.
Biakan dikocok dengan kecepatan 100 rpm, selama satu malam menggunakan pengocok
(shaker) yang diinkubasikan dalam ruang bersuhu 28oC.
Setelah
pembiakan dalam YEP padat yang kedua, tiga sampai lima koloni bakteri yang didapat
dipindahkan ke media YEP cair (50 ml) dengan kedua antibiotik tersebut, dikocok
dengan kecepatan 100 rpm pada shaker dan diinkubasikan dalam ruang
kultur bersuhu 28oC selama semalam. Biakan yang didapat siap digunakan untuk
transformasi tanaman.
Kultur
bakteri yang telah disiapkan disentrifugasi (5000 rpm, selama 10 menit) pada suhu
40C dan endapan bakteri yang didapat dicuci tiga kali dengan media regenerasi
tunas cair tanpa antibiotik. Setelah pencucian, endapan bakteri diresuspensikan
ke dalam 10 ml media regenerasi dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang
600 nm (λ600) dengan blanko media regenerasi. Suspensi bakteri diencerkan
dengan media regenerasi sampai mencapai nilai OD (optic density) sebesar
0,2—0,5. Suspensi bakteri diletakkan dalam remahan es dan siap digunakan untuk
transformasi tanaman.
Transformasi
dan Regenerasi N. Benthamiana Transgenik Inokulasi Agrobacterium.
Transformasi gen dilakukan dengan metode kokultivasi daun N.benthamiana
dengan Agrobacterium. Daun tembakau dipotong-potong
selebar 3—5 mm dengan gunting steril dan ditampung dalam botol
steril yang berisi sedikit cairan media regenerasi. Untuk menginokulasi
potongan daun dengan Agrobacterium suspensi bakteri sebanyak 50 ml yang
telah disesuaikan OD-nya dituangkan ke botol steril yang telah berisi potongan
daun tersebut. Botol steril ditutup dan disegel denganYasin. parafilm kemudian dikocok pelan-pelan pada
shaker selama 5—10 menit. Selanjutnya, potongan daun yang telah diinokulasi
dipindahkan ke kertas tissu steril pada cawan petri untuk menyerap kelebihan
cairan dan suspensi bakteri.
Kokultivasi.
Kokultivasi
potongan daun dengan Agrobacterium dilakukan dengan menanam
potongan daun tersebut dalam botol yang berisi media
regenerasi (media agar) tanpa antibiotik. Pada tahap ini
daun-daun ditata/disusun agak padat dalam media regenerasi. Botol
disegel dan diinkubasi dalam almari es pada suhu 15oC selama
satu hari. Setelah melewati masa kokultivasi, eksplan dicuci
dengan aquades steril beberapa kali sampai aquades tampak bening
dan akhirnya dicuci dengan 50 ml media regenerasi cair
yang mengandung cefotaksim (300 mg/l).
Regenerasi
tanaman transgenik.
Eksplan
yang telah dibersihkan dipindahkan ke media regenerasi padat yang mengandung
antibiotik cefotaksim 300 mg/l selama 3—5 hari. Setelah itu, eksplan dicuci
kembali sebagaimana sebelumnya dan ditanam pada media regenerasi yang
mengandung cefotaksim (300 mg/l) dan kanamisin (100 mg/l) hingga membentuk
tunas (1—2 bulan). Setelah tunas yang terbentuk memanjang, tunas dipotong
menjadi 3 bagian untuk perbanyakan dan ditanam bersama dalam botol media yang
mengandung cefotaksim dan kanamisin. Jika 3 eksplan ini telah tumbuh dengan
baik maka 1 eksplan disubkultur di media regenerasi yang mengandung cefotaksim
dan kanamisin untuk konservasi (disimpan) dalam bentuk kultur. Dua eksplan
lainnya ditanam di media perakaran (MS0). Jika plantlet dari 2 eksplan ini telah
berakar dengan baik maka 1 plantlet dibersihkan dari agar kemudian dipindahkan
ke media tanah untuk aklimatisasi dan 1 plantlet lagi untuk disubkultur lagi ke
media perakaran untuk cadangan jika planlet yang diaklimatisasi mati.
Aklimatisasi
dan Produksi Benih T0:1
Plantlet
yang telah berakar dengan baik dibersihkan agarnya dari perakaran kemudian
dicelupkan ke dalam larutan fungisida Dithane (1g/l) dan dipindahkan ke pot
plastik yang berisi media tanah steril yang telah disiram pupuk N-P-K cair (0,5
gr/l) dan disungkup dengan botol untuk mengurangi penguapan. Biji yang pertama
dihasilkan merupakan biji atau benih T0:1. Biji-biji T0:1 dari tanaman
transgenik CP-1, CP-2, CP-3, dan transgenik CP-4 setelah ditanam kemudian diuji
dengan PStV.
Uji
Ketahanan N. benthamiana Transgenik terhadap PStV
Untuk
menentukan keefektifan gen CP PStV yang diuji, populasi tanaman transgenik yang
masing-masing membawa satu tipe gen CP diinokulasi dengan PStV dan respon
tanaman terhadap inokulasi virusnya ditentukan berdasarkan ada tidaknya
replikasi dan penyebaran PStV di dalam tanaman transgenik.
Sumber
inokulum.
Perbanyakan
sumber inokulum dilakukan pada tanaman kacang tanah cv kelinci yang diinokulasi
secara mekanik dengan PStV isolat Bogor yang tergolong sebagai isolat "severe
bloth-stripe" (Akin, 1998).
Inokulasi
tanaman transgenik dengan PStV.
Inokulasi
PStV dilakukan dengan cara mengoleskan cairan perasan daun kacang tanah
terinfeksi PStV yang telah disiapkan ke N. benthamiana yang telah
ditaburi Carborundum tersebut dengan menggunakan cotton buds.
Hasil
Dan Pembahasan
Dari
data dapat dilihat bahwa masa kritis untuk regenerasi tanaman transgenik hasil
kultur jaringan adalah tahapan aklimatisasi. Dari 180 pucuk calon tanaman
transgenik yang didapat dari proses transformasi yang berhasil menjadi tanaman
di rumah kaca setelah diaklimatisasi hanya 88 tanaman (49%). Selanjutnya, dari
88 tanaman yang didapat tersebut hanya 43 tanaman transgenik generasi T0 (24%)
yang dapat menghasilkan biji T0:1. Untuk gen CP PStV tipe CP-1 didapatkan dua genotip
tanaman transgenik yang menghasilkan biji, sedangkan untuk tipe CP-2 — 5
genotipe, tipe CP-3 — 6 genotipe, CP-4 — 6 genotipe. Untuk gen marker NPTII/GUS didapat 7
genotipe tanaman transgenik yang menghasilkan biji T0:1. Tidak
semua tanaman transgenik dapat tumbuh dan berkembang sampai menghasilkan
biji. Respon tanaman T0 terhadap PStV telah diuji. Beberapa tanaman transgenik
menunjukkan respon tahan terhadap PStV, ada juga tanaman yang rentan terhadap
PStV. Tanaman kontrol yang terdiri dari tanaman transgenik NPTII/GUS dan
tanaman non transgenik semuanya rentan terhadap PStV. Ketahanan tanaman
transgenik terhadap PStV terjadi akibat integrasi gen CP dan bukan karena
integrasi gen marker atau karena proses-proses lain yang dilalui dalam kegiatan
transformasi tanaman dengan bantuan Agrobacterium.
No comments:
Post a Comment